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褐化是指在組培過程中，培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，培養(yǎng)材料也隨之慢慢變褐而死亡的現(xiàn)象。

一、材料為什么會褐化？

（一）、酶促褐化

酶促褐化是在有氧條件下，酚酶催化酚類物質(zhì)形成醌及其聚合物的反應(yīng)過程。組培材料之所以會褐化是因為有些植物（特別是木本植物）體內(nèi)含有較多的酚類化合物和多酚氧化酶。在正常結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞中，酚類化合物與多酚氧化酶是分隔存在的，因此比較穩(wěn)定。當(dāng)外植體被切割后，切口附近細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性受到破壞。酚類化合物和多酚氧化酶的分隔效應(yīng)被打破，酚類化合物和多酚氧化酶便流出，多酚氧化酶氧化酚類化合物而成為褐色的醌類物質(zhì)和水。醌類又會在酪氨酸酶等酶的作用下，使外植體的蛋白質(zhì)聚合，生長停頓，最終導(dǎo)致死亡。

（二）、非酶促反應(yīng)

非酶促褐化是指酚類等物質(zhì)在非酶促條件下被氧化而發(fā)生顯著顏色變化、趨向加深的現(xiàn)象。其主要是受到環(huán)境脅迫所致。

二、引起褐化的主要因素

（一）基因型

木本植物一般比草本植物容易發(fā)生褐變，因為木本植物的單寧或色素含量較高，而酚類的糖苷化合物是木質(zhì)素、單寧和色素的合成前體，所以木本植物易褐變。例如核桃單寧含量很高，組培難度大，即使形成愈傷組織還會因褐變而死亡。另外同一植物的不同品系褐變程度也不一樣，例如在進(jìn)行蘋果莖尖培養(yǎng)時，不同品種之間褐化的程度不一樣，品種“金冠”較輕，而“舞美”則很高。對葡萄等其他作物的研究也發(fā)現(xiàn)類似情況。此外本身色素含量高的植物組培時也容易褐化。

（二）外植體生理狀態(tài)

一般來講，隨著年齡和組織木質(zhì)化程度增加而褐變加強(qiáng)。如在歐洲栗的培養(yǎng)中，幼年型的外植體培養(yǎng)含醌類物質(zhì)少，而用成年型材料培養(yǎng)時含醌類物質(zhì)多。在卡德利亞蘭的培養(yǎng)中，較短的新生莖致褐物質(zhì)含量高，而較長的新生莖致褐物質(zhì)含量低。另外，不同生長季節(jié)取材的培養(yǎng)成功率也不同。王續(xù)衍等（1988）對24個蘋果品種進(jìn)行莖尖培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)冬春季取材褐變死亡率低，其他季節(jié)取材較重。外植體大小會影響褐變，例如，用油棕幼嫩外植體（胚）培養(yǎng)較少褐變，而用高度分化的葉片接種后，則褐變。受傷程度大小也影響褐變。為了減輕褐變，切取外植體盡可能減少傷口面積，切口盡可能平整些。

外植體的老化程度越高，其木質(zhì)素的含量也越高，也就越容易褐變，成齡材料一般均比幼齡材料褐化嚴(yán)重。平吉成用小金海棠、八楞海棠、山定子剛長成的實生苗切取莖尖培養(yǎng)，接種后褐變很輕，隨著苗齡的增長，褐變逐步加重，取自成齡樹上的莖尖褐變就更加嚴(yán)重。幼齡材料褐變輕與其酚類化合物含量少有關(guān)，Chever分析歐洲粟的酚類含量變化也發(fā)現(xiàn)，幼嫩材料酚類化合物含量少，而成齡材料比較多。

    外植體大小對褐變的影響，表現(xiàn)為小的材料更容易發(fā)生褐化，相對較大的材料則褐變較輕，在多個蘋果品種上進(jìn)行試驗表明：用5～l0mm的莖尖培養(yǎng)效果較好。另外，切口越大，酚類物質(zhì)的被氧化面也越大，褐化程度就會更嚴(yán)重。因此外植體的受傷程度對褐化的產(chǎn)生具有明顯的影響，傷口加劇褐化的發(fā)生。仙客來小葉誘導(dǎo)時，整片葉子接種較分成多塊褐化要輕，除機(jī)械損傷外，各種消毒用的化學(xué)試劑對外植體的傷害也會引起褐化，酒精消毒對外植體的傷害比較重，較易引起材料死亡；對于不易褐化的種類，用氯化汞消毒后，一般不會引起褐化，若用次氯酸鈉進(jìn)行消毒，則很容易引起褐化的發(fā)生，而且消毒效果不如氯化汞。

（三）取材時間和部位  

由于植物體內(nèi)酚類化合物含量和多酚氧化酶的活性在不同的生長季節(jié)并不相同，一般在生長季節(jié)含有較多的酚類化合物。有人在蘋果、核桃上試驗證明：冬春季取材褐變死亡率最低，在夏季時取材更容易被氧化褐變。在取材部位上存在幼嫩莖尖較其他部位褐化程度低的現(xiàn)象，木質(zhì)化程度高的節(jié)段在進(jìn)行藥劑消毒處后褐化現(xiàn)象更嚴(yán)重。

    另一些種類如蝴蝶蘭、香蕉等隨著培養(yǎng)時間的延長，褐化程度會加劇，甚至在超過一定時間不進(jìn)行轉(zhuǎn)瓶繼代，褐化物的積累還會引起培養(yǎng)材料的死亡。

（四）外植體培養(yǎng)條件

如從田間自然光照下植株取蘋果、桃、葡萄等的莖尖，接種后容易褐變；如事先對母株或枝條遮光處理，之后再切取外植體，則減少褐變，因為酚類化合物合成和氧化過程中，有一部分酶系統(tǒng)的活性是受光誘導(dǎo)的。此外，光照促進(jìn)組培中酚的氧化，光照條件對巨桉葉片滲出物形成的影響從低到高為：黑暗、漫射光、短日照、長日照。因此，在黑暗或低光照培養(yǎng)一段時間能減輕褐變。

在采取外植體前，如果將材料或母株枝條進(jìn)行遮光處理，然后再切取外植體培養(yǎng)，能夠有效地抑制褐化的發(fā)生。將接種后的初代培養(yǎng)材料在黑暗條件下培養(yǎng)，對抑制褐化發(fā)生也有一定的效果，但不如在接種前處理有效。無光抑制褐化的原因是由于在氧化過程中，許多反應(yīng)受酶系統(tǒng)控制，而酶系統(tǒng)活性受光照影響。應(yīng)該注意，暗培養(yǎng)時間過長會降低外植體的生活能力，甚至引起死亡，應(yīng)該通過試驗摸索出適宜的時間。

溫度對褐變有很大的影響，卡特蘭在15-25℃培養(yǎng)比在25℃以上褐變輕；蘋果和桃的莖尖培養(yǎng)也是低溫抑制褐變。Ishii等發(fā)現(xiàn)在15～25℃下培養(yǎng)卡特蘭比在25℃以上時褐化要輕，Hildebrandt和Hamey在培養(yǎng)天竺葵莖尖的過程中，不僅發(fā)現(xiàn)7℃以下培養(yǎng)比在17℃和27℃下褐化變輕，而且還證明了高溫能促進(jìn)酚氧化，而低溫可抑制酚類化臺物氧化，降低多酚氧化酶的活性，從而堿輕褐化。王明華等在褐化嚴(yán)重的蘋果品種上也證明了低溫有抑制褐化的作用。

（五）培養(yǎng)基

許多試驗表明，液體培養(yǎng)基有效地克服外植體褐變，液體培養(yǎng)基再加上濾紙橋，效果就更好。因為外植體溢出的有毒物質(zhì)很快擴(kuò)散到液體培養(yǎng)基中，對外植體危害較輕。

在初代培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度過高，會引起酚類物質(zhì)大量產(chǎn)生，導(dǎo)致褐變；降低鹽濃度可減少酚類外溢，減輕褐變。

生長調(diào)節(jié)劑是影響褐變的主要原因，6－芐氨基腺嘌呤或激動素不僅促進(jìn)酚類化合物合成，而且刺激多酚氧化酶的活性，增加褐變；而生長素類如2，4-D和NAA可延緩多酚合成，減輕褐變。

在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑可改變外植體周圍的氧化還原電勢，從而抑制酚類氧化，減輕褐變。目前應(yīng)用的抗氧化劑有硫代硫酸鈉、蘇糖二硫醇、抗壞血酸、間苯二酚等。同一種藥劑在不同培養(yǎng)基中效果不一樣，抗氧化劑在液體培養(yǎng)中比在固體培養(yǎng)基中效果更好。

活性炭和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是吸附劑，可以吸附外植體周圍的有毒物質(zhì)；活性炭還可一定程度的降低光照強(qiáng)度，減輕褐變。

三、預(yù)防褐化的措施

（一）選擇適宜的外植體和培養(yǎng)條件

大量研究表明，選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w和培養(yǎng)條件是克服褐變的最主要手段。通常外植體應(yīng)有較強(qiáng)的分生能力，在最適宜的細(xì)胞脫分化和再分化培養(yǎng)條件下，使外植體處于旺盛的生長狀態(tài)，便可大大減輕褐變。適宜的溫度和在全黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)也可顯著減小外植體的褐變。據(jù)報道，如在芽初始培養(yǎng)的1-6周內(nèi)，用黑暗培養(yǎng)或光強(qiáng)度在150Lx可抑制外植體的酚類氧化。對于易褐變的材料，接種后轉(zhuǎn)瓶時間長，傷口周圍積累的醌類物質(zhì)增多，則褐變加重；而縮短轉(zhuǎn)瓶周期常�？蓽p輕褐變。如在山月桂樹的莖尖培養(yǎng)中，接種后12-24h，便轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，在此之后的一周內(nèi)，每天轉(zhuǎn)一次瓶，外植體褐變可得到完全控制。

（二）加入抗氧化劑

在組織培養(yǎng)中，加入一些氧化劑或用抗氧化劑進(jìn)行材料（外植體）的預(yù)處理或預(yù)培養(yǎng)，可大大減輕醌類物質(zhì)的毒害。這些抗氧化劑包括：VC、檸檬酸、硫代硫酸鈉（Na2S2O3）等。在倒掛金鐘莖尖培養(yǎng)中加入0.01％PVP對褐變有抑制作用，而用0.7％PVP，0.28mol·L－1抗壞血酸，雙氧水（5％）一起加入到0.58 mol·L－1蔗糖溶液中振蕩45min，對褐變有明顯抑制作用。而在卡特利亞蘭莖尖培養(yǎng)中，將5mmol·L－1氰化鉀、抗壞血酸、半胱氨酸和硫脲加入到液體培養(yǎng)基中，對多酚氧化酶的活性有明顯的抑制作用。在靜止的液體培養(yǎng)中加入抗氧化劑比在固體培養(yǎng)基中加入的效果要明顯的多。此外，0.1％-0.5％活性炭對吸附酚類氧化物的效果也很明顯（王敬駒等，1983）。

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